m6A-immune-related lncRNA prognostic signature for predicting immune landscape and prognosis of bladder cancer

用于预测膀胱癌免疫状况和预后的m6A-免疫相关lncRNA预后特征

发表期刊：J Transl Med

发表日期：2022 Oct 29

影响因子：8.440

DOI:  10.1186/s12967-022-03711-1

一、研究背景

        膀胱癌是全球第十大最常见的恶性肿瘤，每年在全球造成约17万人死亡。长非编码RNAs（lncRNAs）长度超过200个核苷酸，一般不能转化为蛋白质。lncRNAs通过转录和转录后调节基因表达，参与细胞生长、分化和增殖。以前的报告显示，lncRNAs的表达失调在膀胱癌的致瘤性和转移中至关重要。

        作为最常见的RNA修饰，N6-甲基腺苷（m6A）不仅出现在信使RNA（mRNA）中，也出现在lncRNA中。m6A甲基化几乎影响了所有的RNA代谢环节，包括RNA易位、剪接、稳定和翻译。

二、材料与方法

1、数据来源

1）从TCGA数据库获取膀胱癌突变数据、转录组数据和相应的临床信息

2）从GEO获取GSE154261数据集

3）T24和RT-112，两个膀胱癌细胞系

2、分析流程

1）鉴定与m6A免疫相关的lncRNAs：lncRNAs和m6A调节器之间的Pearson's相关性分析；分析lncRNAs和CIBERSORT免疫组分之间的相关性；Univariate Cox比例风险回归分析

2）m6A免疫相关lncRNA风险模型的构建和验证：LASSO Cox回归；患者被划分为低风险组和高风险组，从多个维度分析高危组和低危组的差异，包括临床特征、这些lncRNAs和m6A调节器的表达水平、免疫浸润估计（TIMER、CIBERSORT和TCIA）、细胞干性指数、肿瘤突变负担和常见突变基因

3）m6A-免疫相关lncRNA风险模型的验证：风险模型的预后能力是用KM生存曲线来评估的

4）基因集富集分析（GSEA）和通路注释：GSEA是在R软件中使用 "clusterprofiler "包进行的

5）细胞系和细胞培养、伤口愈合和侵袭试验、菌落形成试验

三、实验结果

01 - 识别膀胱癌中与m6A免疫相关的lncRNAs

        图1A为工作流程，共有814个lncRNAs被纳入本研究中。通过Pearson相关分析，618个lncRNAs被确定为与至少一个m6A调节因子有显著相关性（图1B）。同样，通过Pearson相关分析，490个lncRNAs被确定为与免疫有关的lncRNAs，这些lncRNAs与CIBERSORT免疫组分之间的相关性分析（图1C）。使用lncRNAs Univariate Cox回归分析筛选出总生存期和无进展生存期相关的预后，49个lncRNAs显示出预后价值（图1D）。图1E显示了这47个共享的lncRNAs和CIBERSORT免疫分型以及m6A调节器之间的相关性。

图1 m6A免疫相关lncRNAs的流程图和鉴定

02 - 构建m6A-免疫相关的lncRNA风险评分及其与临床病理特征的相关性

        对与m6A调节剂和CIBERSORT免疫组分都有明显相关性的共同lncRNA进行LASSO-Cox回归分析，构建预测总生存期的风险评分。图2A是使用11个选定的lncRNAs构建的风险模型，图2B是每个lncRNA的系数，图2C是无进展生存期、总生存期和疾病特异性生存期的森林图。计算风险分数，并根据中值将其分为低风险或高风险亚组。图2D显示了风险分数和临床病理特征之间的相关性。较高的风险分数表明膀胱癌患者的分期较晚，大多数高危组肿瘤为基底鳞状亚型，而大多数低危组肿瘤为腔内乳头状亚型。图2E显示了预后较差的高危组。

图2 构建m6A-免疫相关的lncRNA风险评分及其与临床病理特征的相关性

        使用ROC曲线评估了风险模型的可靠性和敏感性，但是仅依靠风险评分的风险模型可能不足以预测患者的预后。因此，风险评分与其他关键的临床特征相结合，包括诊断年龄、病理肿瘤分期和三个综合nomogram，对OS、PFS和DSS进行了预测。图3A-C显示了高危组和低危组的无进展生存期、总生存期和疾病特异性生存期的Kaplan-Meier图的比较。通过使用 "timeROC "软件包中的时间依赖性ROC分析，图3A-C显示了这三个nomogram在1、3和5年的AUC。所有1年的AUC都大于0.74，表明该模型显示出重要的预后价值。为了验证该模型的预测准确性，作者将其应用于GEO（GSE154261）的一个独立数据集，该数据集提供了总生存数据。ROC分析表明，该模型的AUC接近于TCGA数据集的AUC，表明该模型在其他数据集中是稳健的（图3D）。

图3 nomogram的构建和GEO数据集的验证

03 - 高危组和低危组之间的肿瘤突变率、突变负担和肿瘤免疫微环境评分的比较

        确定了风险评分与肿瘤突变率、突变负担、肿瘤免疫微环境评分和肿瘤干性指数之间的关系。膀胱癌中一些常见的突变基因在低风险组和高风险组之间表现出明显的差异。低危组中KDM6A的突变率比高危组低12%（图4A）。低风险组的患者有较高的突变负担（图4B）。Immunophenoscore被用来预测膀胱癌患者对免疫检查点抑制剂（ICI）的潜在反应。统计分析结果显示，低风险组的免疫分值比高风险组大，这意味着低风险组的患者可能有更强的免疫原性，可能对免疫疗法更敏感（图4C）。使用肿瘤免疫评估资源（TIMER）算法计算，高危组的所有浸润性免疫细胞，包括CD4 +和CD8 + T细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B细胞和巨噬细胞都比低危组的丰富（图4D）。有趣的是，低风险组显示出更高的干性指数，表明细胞干性和免疫原性在膀胱癌中发挥不同的作用（图4E）。相关矩阵显示了风险分数和这些因素之间的关系（图4F）。21个m6A调节因子和11个m6A免疫相关的lncRNAs的表达热图显示了它们与风险评分的关系（图4G，H）。按风险评分对患者进行分类，在CIBERSORT馏分的热图中可以观察到肿瘤微环境的明显转变（图4I）。低风险组巨噬细胞的浸润比例明显低于高风险组，而高风险组的幼稚T细胞则缩减。

图4 高风险组和低风险组之间的比较

04 - GSEA和通路相关分析

        作者进行了GSEA，以确定与该风险模型相关的途径。如图5a所示，"go_stem_cell_proliferation"、"go_epithelial_cell_proliferation"、"hallmark_epithelial_mesenchymal_transition"、"go_regulation_of_stem_cell_differentiation"、"go_negative_regulation_of_b_cell_activation" "GO_NEGATIVE_REGULATION_OF_IMMUNE_RESPONSE"、"GO_NEGATIVE_REGULATION_OF_MACROPHAGE_ACTIVATION "和"GO_NEGATIVE_REGULATION_OF_T_CELL_MEDIATED_IMMUNITY "与风险评分明显呈正相关。这一结果表明，该模型与肿瘤的增殖、迁移、侵袭和肿瘤免疫微环境高度相关。通过使用R语言中的 "Pathview "和 "ggnetwork "包，这些通路之间的关系被可视化（图5B，C）。11个lncRNAs和它们最相关的免疫基因之间的关系也被可视化了（图5D）。

图5 GSEA和路径相关分析

05 - GDSC的药物敏感性分析和体外验证

        将风险模型应用于CCLE，并计算出膀胱癌细胞系的风险得分。如图6A所示，T24的风险得分最高，而RT-112的风险得分最低），与以前的膀胱癌研究一致，表明T24的恶性程度相对高于其他细胞系。作者通过进行集落形成、伤口愈合和侵袭试验，进一步在体外验证了这些结果（图6B-D）。此外，通过在GDSC中应用药物敏感性数据，在细胞系风险评分和药物IC50值之间进行了Pearson相关分析。在风险分数和塔拉唑帕里的IC50之间发现了明显的负相关，这意味着风险分数高的患者对塔拉唑帕里更敏感（图6E）。计算了塔拉唑帕里在T24中的IC50（2μM）（图6F），并进行了菌落形成试验，结果显示T24细胞对塔拉唑帕里敏感（图6G-I）。这可能为膀胱癌的靶向治疗提供理论依据。

图6 药物敏感性分析和体外验证

四、结论

        从TCGA-BLCA队列中发现了11个与m6A免疫相关的lncRNAs，并构建了一个具有强大预后价值的风险评分模型。这个模型可以预测膀胱癌患者对免疫疗法的反应。本研究结果对m6A-免疫相关lncRNAs在膀胱癌肿瘤发生、发展和肿瘤免疫微环境构建中的功能提供了重要的见解。